Permeação Cutânea intradermoterapia, mesoterapia, eletropermeação

Aumento da Permeação Cutânea através de Métodos Físicos focando na Eletroporação

Aqui você encontra a transcrição do Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Velasco, como requisito para obtenção do título de Especialista em Harmonização Orofacial da Dra Kristine Soldatelli. Orientador: Professora Roberta Zaideman Azar


Veja no final deste artigo como assistir à apresentação do trabalho e baixar o arquivo em PDF.


1. INTRODUÇÃO

O aumento do potencial do uso da rota transdérmica de fármacos tem sido de grande procura na indústria farmacêutica e na área médica. É uma alternativa útil às vias convencionais de administração, como as vias oral ou injetável (1,2). Evita a degradação no trato gastrointestinal e o metabolismo hepático de primeira passagem (3). A via transdérmica permite uma administração controlada constante ou variável no tempo e melhora a adesão do paciente ao tratamento. Além é claro, de ser um ramo extremamente lucrativo.

O mercado mundial de substâncias transdérmicas foi avaliado em US$ 2 bilhões no ano 2000 e representa o mais bem sucedido sistema de entrega de medicamentos não orais (4). Em 2005 o investimento nesta área especializada foi em torno de U$ 13 bilhões com previsão de crescimento para U$ 22 bilhões em 2010. Em 2015 o valor alcançou U$32 bilhões (2). O modo transdérmico apresenta muitas vantagens distintas ,como por exemplo, uma extensa área acessível (1-2m2) para absorção (4). No entanto, pouquíssimos medicamentos podem ser administrados por esta via devido à baixa permeabilidade da pele.

Para moléculas carregadas ou polares e macromoléculas, a distribuição de quantidades terapêuticas através da pele é difícil. Por essa razão as aplicações práticas ainda permanecem limitadas a uma gama estreita de fármacos, devido à camada de barreira da pele, o estrato córneo (EC), que proporciona uma baixa permeabilidade a moléculas exógenas.

Abordagens químicas e físicas para aumentar o transporte transdérmico têm sido exploradas para potencializar a permeabilidade da pele e expandir a gama de medicamentos que podem ser administrados por via transdérmica .Entre os meios químicos para otimizar a permeação passiva dos ativos encontram-se: manipulação das formulações, microemulsões, sistemas lipossomais e soluções supersaturadas. E nos sistemas de entrega utilizando propriedades físicas que intensificam a permeação. Métodos como ultrassom, lasers, microagulhamento e campos elétricos tais como iontoforese e a eletroporação (3,4,5,6).

Este estudo abrange uma propriedade física, a eletroporação, para aumentar o transporte transdérmico. A iontoforese será descrita brevemente pois também faz uso de aplicações de correntes elétricas podendo gerar dúvidas ao leitor sobre as duas técnicas.

2. OBJETIVO

O presente estudo tem por objetivo apresentar a técnica de eletroporação como um meio possível de aumentar a permeação de ativos de alto peso molecular e hidrofílicos.

3. REVISÃO DE LITERUTURA

3.1 A pele – Estrato Córneo

Por mais de 150 anos a estrutura da pele e sua função tem sido assunto de muita investigação dos cientistas (5). O estrato córneo é uma membrana extraordinária. Sua função barreira previne a entrada de diversos patógenos como poluentes, vírus, bactérias e espectro da radiação solar. Sendo vital para homeostase da temperatura corpórea, eletrólitos e equilíbrio de fluidos. Evita também a perda de água transepidermal. Da mesma forma o estrato córneo não permite a entrada de maneira passiva de moléculas com alto peso molécular, polares e hidrofílicas.

O estrato córneo tem uma organização estrutural de dois compartimentos muito simples ao nível microscópico de luz, com os corneócitos embutidos em uma matriz lipídica. Isso levou à sua comparação com um “sistema de tijolo e argamassa” originalmente descrito por Michaels et al. 1975 (6). No nível ultraestrutural, tanto os tijolos quanto os componentes de argamassa do EC têm uma incrível complexidade estrutural e funcional, adaptações metabólicas e capacidade de automanutenção por renovação constante.

a) Os corneócitos: Células sobrepostas entre 18-20 camadas dependendo da localização anatômica no corpo; estes fornecem a barreira física.
b) Corneodesmossomos: funcionam como “soldas a ponto” ou “rebites” para manter os corneócitos juntos. Os desmossomos são programados para passar por um processo de degradação gradual, de modo a permitir a descamação ordenada dos corneócitos mais externos e desgastados.
c) Os lipídios da “argamassa” preenchendo o caminho tortuoso entre os corneócitos sobrepostos: uma mistura altamente complexa com cerca de 13 espécies de ceramidas, colesterol e ácidos graxos livres em proporção equimolar; estes fornecem a barreira de permeabilidade.
d) Uma bateria de enzimas lipolíticas e proteolíticas: envolvidas no processamento de lipídios pró-barreira e degradação de desmossomos, respectivamente,
contribuem para atividades bioquímicas contínuas no estrato córneo, que antes se pensava estar inerte e morto.
e) O conteúdo secretado dos corpos lamelares epidérmicos na interface do estrato córneo e do estrato granuloso: são os lipídios pró-barreira que dão origem às múltiplas lamelas lipídicas do SC e que se intercalam com as enzimas e peptídeos antimicrobianos.
Os principais componentes estruturais deste sistema composto podem ser representados pelo desenho esquemático da pele.

Todos esses componentes são cruciais para a barreira do estrato córneo, que é visto como um desafio para a administração transdérmica de drogas. Interferir ou alterar as propriedades funcionais de qualquer um desses componentes pode enfraquecer a função barreira. Superar a propriedade notável da barreira da pele de uma maneira temporal, eficaz e segura ao mesmo tempo tem sido um desafio constante para a indústria farmacêutica e para a medicina (5). Abordagens químicas e físicas para aumentar o transporte transdérmico têm sido exploradas para potencializar a permeabilidade da pele e expandir a gama de medicamentos que podem ser administrados por via transdérmica.

3.2 Base da Função de Barreira de Membrana de Bicamada Celular

Formada por uma bicamada lipídica (com espessura variável na ordem de É amplamente conhecido que as células possuem membranas para separar os nanômetros) que normalmente impede a passagem de íons e outras compartimentos extra e intracelular. Algumas moléculas utilizadas pelas células moléculas. Partes da membrana possuem complexos proteicos que são facilitadores do transporte de substâncias(canais e bombas iônicas). Essas possuem mecanismos específicos de transporte transmembrana. Isso ocorre através de estruturas podem funcionar por difusão (canais iônicos) ou serem
um meio de transporte relativamente inespecífico que é conhecido por permeação comandadas por sinais elétricos ou químicos com uso de energia (bombas difusa.

Algumas partes da membrana possuem complexos proteicos que são iônicas). A troca de substâncias é necessária para garantir a homeostase facilitadores do transporte de substâncias (canais e bombas iônicas). Essas estruturas celular, ou seja, o equilíbrio de vários fatores que tornam a célula saudável. Na Figura 4 está representado a organização da membrana podem funcionar por difusão (canais iônicos) ou serem comandadas por sinais elétricos celular ou químicos com uso de energia (bombas iônicas). A troca de substâncias é necessária para garantir a homeostase celular(8).

A diferença de potencial elétrico entre o lado interno e externo de sua membrana plasmática, gerada e regulada por um sistema de bombas iônicas e canais na membrana, denominada voltagem transmembrana de repouso (TMV). Em células eucarióticas, o TMV de repouso normalmente varia de –40 a –70 mV, no sentido de que o potencial interno é menor que o externo. Como este é o estado natural das membranas biológicas, tanto seus componentes lipídicos quanto proteicos são evolutivamente bem adaptados e funcionam sob voltagens nesta faixa (9).

Correlação entre Tensão Transmembrana e Eletroporação:

A exposição de uma célula a um campo elétrico externo resulta em um componente adicional de TMV, denominado TMV induzido, sustentado pela duração da exposição e proporcional à força do campo elétrico externo. Assim, exposições a campos suficientemente fortes podem induzir TMVs excedendo significativamente sua faixa de repouso e causando tanto mudanças estruturais na membrana quanto mudanças em suas moléculas constituintes que não ocorrem em condições fisiológicas.

Correlação entre tensão transmembrana e transporte mediado por eletropermeabilização:
Entre os efeitos mais claros e proeminentes está a eletropermeabilização/eletroporação da membrana. Um aumento rápido e substancial na permeabilidade da membrana, revelado pelo transporte transmembranar de moléculas para as quais uma membrana intacta é praticamente impermeável.
Voltagem transmembrana induzida (TMV induzido): aumento da voltagem transmembrana resultante da exposição a pulsos elétricos e associado a um aumento no campo elétrico transmembrana

Vários estudos, baseados em considerações experimentais e teóricas, implicaram que o fluxo molecular através da membrana eletropermeabilizada é amplamente limitado às regiões da membrana expostas a TMV suficientemente alto. Isso foi conclusivamente demonstrado experimentalmente, para uma única célula, bem como grupos de células, monitorando tanto o TMV quanto o transporte transmembrana nas mesmas células após sua exposição a pulsos elétricos (9).

Para uma melhor compreensão, aos interessados nesta área de estudo, recomenda-se a leitura do livro: Métodos em Biologia Molecular capítulo Teoria da Eletroporação Conceitos e Mecanismos James C. Weaver (10)

3.3 Base de Meios Físicos que Aumentam a Permeabilidade Cutânea Através de Correntes Elétricas

3.3.1 Iontoforese

A iontoforese permite a entrada de drogas ionizadas e não ionizadas com baixo perfil de permeação através da membrana celular. Consiste na aplicação de uma corrente elétrica de baixa intensidade (0,5 mA/cm2 ou inferior) baixa voltagem (<100V), de forma pulsátil ou contínua e por longo período de tempo. Isto promove o movimento de fármacos através das membranas biológicas (11). A magnitude da corrente determina a quantidade de energia gerada no circuito e em troca um determinado número de íons são transportados pela pele.

A quantidade de íons transpassados é proporcional a quantidade de carga utilizada. O tempo estendido da aplicação da corrente elétrica promove o aquecimento do local, causando assim um efeito térmico sobre o tecido. A aplicação é indicada para drogas com um limite de peso molecular de 20KDa (12). Assim, a iontoforese proporciona uma força motriz eletroquímica para o transporte de fármacos através da pele, em vez de aumentar a sua permeabilidade pela alteração da sua estrutura (figura 5). Como tal, aplica-se geralmente a moléculas carregadas e algumas macromoléculas com peso molecular até 15 kDa (8).

Existem dois mecanismos principais para o transporte das moléculas através desta técnica, sendo o mais comum designado por eletrorrepulsão, baseando-se no princípio de que cargas iguais se repelem. Consiste na repulsão de moléculas de fármaco carregadas por um elétrodo com a mesma polaridade, que as força a entrar na pele. O outro mecanismo denomina se eletroosmose e origina um fluxo de solvente do ânodo para o cátodo, devido à aplicação de corrente elétrica na pele (membrana carregada negativamente), e que se aplica à difusão de moléculas neutras (tem que encontrar o artigo). Uma vantagem desta técnica reside no fato de que a velocidade de liberação do fármaco é dependente da corrente aplicada

3.2.2 Eletroporação

A eletroporação (EP) é o fenômeno de aumento da permeabilidade da membrana celular (dupla camada lipídica) quando a célula é exposta a campos elétricos de amplitude acima de dezenas de KV/m e duração de nanosegundos a segundos. O aumento da permeabilidade é explicado pela formação de poros na membrana celular. Dependendo da configuração do protocolo aplicado a membrana plasmática pode se fechar caracterizando a eletroporação reversível ou não se recuperar causando um processo irreversível levando a morte celular.

4. HISTÓRIA DA ELETROPORAÇÃO

De acordo com os pesquisadores Ivorra e Rubinsky (13) o provável primeiro registro de eletroporação ocorreu em 1754, quando Nollet percebeu e registrou a formação de marcações vermelhas na pele de humanos e animais em áreas onde eram aplicados centelhamentos elétricos. Ao longo dos próximos dois séculos, Ritter em 1802, Frankenhaeuser & Wide ́n em 1956, e Stampfli & Willi em 1957 relataram que a eletroporação da membrana nervosa pode explicar as mudanças de condutividade elétrica nos nervos que foram danificados por campos elétricos. A aplicação médica da eletroporação começou em 1982 com o trabalho inspirador de Neumann e colaboradores. Esses autores usaram campos elétricos pulsados para permeabilizar temporariamente as membranas celulares para entregar DNA estranho nas células (14).

Na década seguinte, a combinação de campos elétricos pulsados de alta voltagem com o quimioterápico bleomicina e com DNA rendeu novas aplicações clínicas: eletroquimioterapia e eletrotransferência de respectivamente. Nos últimos anos, a eletroporação irreversível não térmica (NTIRE) para ablação de tumores sólidos surgiu como uma nova aplicação médica da tecnologia de eletroporação.

Segundo Pintarelli (8) Atualmente, eletroporação é um tópico de pesquisa consolidado e de crescente interesse. Como pode ser percebido pelo acréscimo no número de publicações que citam o tema. O número de aparições da palavra “electroporation” em artigos científicos entre 1985 e 2017 é disponível na Figura 6.

Na Figura 6 também são indicados alguns eventos importantes em eletroporação, são esses:

  • Em 1983: criação da empresa BTX do grupo Harvard Bioscience. Esta foi a primeira empresa a vender eletroporador comercial para transferência genética; • Em 1989: primeiro livro sobre eletroporação (JORDAN; NEUMANN; SOWERS, 1989);
  • Em 2004: primeiro trabalho no Brasil em eletroporação pelos pesquisadores Airton Ramos e Daniela O. H. Suzuki (RAMOS; SUZUKI; MARQUES, 2004); • Em 2006: criação da padronização para tratamento de câncer por eletroquimioterapia (ESOPE, “Standard Operating Procedures Of The Electrochemotherapy”) (MIR et al., 2006);
  • Em 2015: primeiro congresso em eletroporação em Portorož, Slovenia; • Em 2017: publicação do livro Handbook of Electroporation (MIKLAVCIC, 2017); • Em 2018: atualização do ESOPE (GEHL et al., 2018).
  • Ocorrências da palavra “electroporation” em qualquer parte de trabalhos científicos de 1985 até 2017.
  • Dados retirados do banco de dados do Google Scholar dia 12 de janeiro de 2018 usando ferramenta disponível em repositório online (GITHUB, 2018).

5. ELETROPORADOR

A aplicação da eletroporação necessita de um eletroporador. Este equipamento opera com saída de pulsos de tensão na ordem de centenas de Volts e corrente na ordem de dezenas de Amperes. O eletroporador necessita de eletrodos para aplicação de campos elétricos em tecidos biológicos ou amostras biológicas (8).

É de conhecimento que a eletroporação tem relação com amplitude, frequência, forma, número e taxa de repetição do pulso. A combinação de diversas possibilidades paramétricas (amplitude, duração e número de pulsos), inseridas pelo operador do eletroporador, possibilita atingir de maneira reversível ou irreversível os sistemas celulares de células animais e vegetais, seja esses preparados em suspensão de células ou tecido, e in vivo ou in vitro. Os parâmetros elétricos dos pulsos (forma da onda, voltagem, duração e intervalo entre pulsos), as propriedades físico-químicas das moléculas (carga, lipofilicidade e peso molecular), bem como o seu reservatório influenciam o controle da administração transdérmica dos fármacos por eletroporação. O equipamento eletroporador corresponde a um gerador tanto de pulsos de decaimento exponencial (ED) quanto de pulsos de onda quadrada (SW)(9, 21).

Atualmente não existe, no mercado brasileiro, um aparelho eletroporador para uso estético que siga o protocolo estabelecido pela técnica. No artigo The Effect of Electroporation of a Lyotroic Liquid Crystal Genistein-Based Formulation in the Recovery of Murine Melanoma Lesions (22), o aparelho Mezoforte Duo Mez 120905-D foi usado na pele de camundongos para observar a redução de tumores através do uso da genisteína e eletroporação. Este equipamento foi o mais próximo encontrado nesta revisão de literatura para uso estético. Não havia imagem do equipamento no artigo apenas um agradecimento à clinica Derm Clinic of Anti-Aging Dermatology, Aesthetic Laser and Plastic Surgery (Budapeste, Hungria) que emprestou o aparelho para a pesquisa. O dispositivo e a aplicação foram descritos da seguinte forma: opera com base em um campo eletromagnético pulsado. A peça de mão de tratamento revestida de polipropileno contém um eletrodo de placa de 25 mm de diâmetro. A modulação foi conseguida com pulsos de alta tensão de 1800 V com duração de pulso de tensão de 5 ms seguido de uma pausa de 20 ms. O tempo de tratamento foi de 6 minutos (22).

Porém, foi encontrado nesta revisão um aparelho desenvolvido pelo Engenheiro eletricista, Guilherme Brasil Pintarelli em sua dissertação de mestrado em 2018 na UFSC (Universidade Federal de Santa Catarina). Este equipamento eletroporador foi desenvolvido para aplicação de pulsos de tensão elétrica de amplitude, período e forma de onda variáveis e análise técnicas de eletroporação na transfecção genética e tratamento de neoplasias (8).

6. FENÔMENO DE FORMAÇÃO DO PORO

As quatro principais etapas envolvidas na reorganização transiente da membrana são:

  • Etapa i: Membrana íntegra e indução do potencial transmembrana: Não há detecção de eletroporação. A aplicação de campo elétrico externo (1ns a 1s) induz aumento do potencial transmembrana. O carregamento da membrana deve-se ao fluxo de íons, conforme representado na figura 11. Quando o potencial transmembrana atinge um valor crítico (superior a 200 mV, e na maioria dos casos pode atingir 1 a 1,5 V em células eucariontesinicia-se a reorganização molecular da membrana (Etapa ii). Observa-se que o potencial transmembrana é equivalente a um campo elétrico sobre a membrana da ordem de 108 V/m (em porção típica de membrana de 5 nm).
  • Etapa ii : Formação de poros hidrofóbicos (ou pré-poros): Aqui caminhos temporários e limitados para o transporte molecular são formados. Mas depois de cessar o pulso elétrico o transporte cessa e a célula se mantém viva. O potencial transmembrana crítico desencadeia uma “explosão” de reorganizações na estrutura molecular da membrana. Nessa situação o campo elétrico entre a membrana dielétrica é superior ao que essa estrutura pode suportar. Esse tipo de poro é instável e desaparece por flutuações naturais da membrana caso seu raio seja menor que o raio crítico (retorna à Etapa i). Caso ele apresente um raio superior ao raio crítico, ele torna-se um poro hidrofílico (Etapa iii).
  • Etapa iii: Formação de poros hidrofílicos (reversíveis): As cabeças das moléculas lipídicas “giram” para o interior da parede dos poros (forma toroidal), isso minimiza o contato das caudas de lipídeos, que são hidrofóbicos as moléculas de água presentes nos meios extra e intracelular. O interior do poro é preenchido com água, esse acontecimento permite o transporte de íons e outras moléculas através da membrana. O raio crítico é o raio limiar para o poro hidrofóbico tornar-se poro hidrofílico. O sistema se reorganiza na configuração que necessita a menor quantidade de energia para existir. O raio crítico é teórico e observado com auxílio de modelos matemáticos de reorganização da membrana em nível molecular. acontecimento permite o transporte de íons e outras moléculas através da membrana.
  • Etapa iv: Formação de poros irreversíveis (destruição da membrana): Caso a amplitude do campo elétrico aplicado seja muito elevada é criado poros irreversíveis, nesse estado a membrana não é capaz de retornar ao estado inicial 1. A recuperação (resealing) ou não da membrana dependerá da operação reversível ou irreversível da eletroporação, que depende dos parâmetros do campo e condições do sistema biológico. A densidade e raio dos poros podem depender de condições do sistema biológico (tamanho, formato, tipo e concentração celulares e tipos de tecidos) e parâmetros de eletroporação (amplitude, duração e forma de onda de campo elétrico aplicado

7.CONSIDERAÇÕES DA OBSERVAÇÃO DA ELETROPORAÇÃO

Para voltagens transmembranares de centenas de milivolts, o número de porosse torna grande o suficiente, e seus tempos de vida médios são longos o suficiente (de milissegundos a minutos), para um aumento detectável da permeabilidade da membrana a moléculas que de outra forma seriam incapazes de atravessar a membrana.

Semelhante à formação de poros, a resselagem de poros é um processo estocástico, mas ocorre em uma escala de tempo muito mais longa. Especificamente, a formação de eletroporos leva de nano a microssegundos, enquanto sua vedação – revelada pelo retorno da condutividade elétrica da membrana ao seu valor de preporação e pelo término do transporte transmembranar detectável – geralmente é completada apenas em segundos, ou mesmo minutos, após o fim da exposição (24).

O princípio molecular da formação de poros (e transporte molecular através da membrana) ainda não é completamente entendido. Chang em 1990 desenvolveu uma técnica de “de congelamento rápido após eletroporação” seguido de técnica de microscopia e obteve imagens de estruturas semelhantes aos poros, porém a experimentação não foi reproduzida novamente (25). Os poros aquosos na bicamada têm raios de no máximo vários nanômetros, o que é muito pequeno para ser observável por microscopia óptica e a preparação da amostra necessária para microscopia eletrônica de matéria mole (vacuumização, fixação e/ou revestimento metálico) é muito dura para preservação confiável de estruturas semiestáveis na bicamada, de modo que os poros não possam ser claramente distinguidos dos artefatos (19).

As técnicas de microscopia são agressivas e afetam a estrutura de poros. Atualmente, não há técnica experimental definitiva para observação direta da eletroporação (abertura de poros) e há esforços para descoberta de novas metodologias (26). A eletroporação geralmente é estudada baseada em medições indiretas. No entanto, há evidências bastante convincentes em favor da teoria da formação de poros aquosos na forma de simulações de dinâmica molecular. Essas simulações confirmam amplamente a visão hipotética da sequência de eventos em escala molecular e também mostram um claro aumento na taxa de formação de poros com o aumento do campo elétrico ao qual a membrana é exposta – primeiro através da ação direta do campo externo, e então aumentada pela indução da voltagem transmembrana resultante da polarização (27).

No entanto, a duração desses microporos aquosos pode ser aumentada quando a eletroporação é acoplada com intensificadores químicos, iontoforese ou sonoforese (2).

8. DISCUSSÃO

A primeira questão chave abordada neste estudo através da literatura foi avaliar a viabilidade da entrega transdérmica de macromoléculas por eletroporação da pele. Segundo o trabalho de Prausnitz em 1997, devido às grandes propriedades de barreira da pele, a entrega de compostos de alto peso molecular não era uma opção realista. No entanto, os dados mostram que a eletroporação da pele pode ser um método muito promissor (28).

A eletroporação é um método eficiente para melhorar a entrega transdérmica de drogas in vitro e in vivo, e expande a gama de compostos entregues transdermicamente. Pode ser uma alternativa promissora como entrega não invasiva de macromoléculas pelo menos de 40 kDa e entrega transdérmica rápida e/ou pulsátil. Combinada com outros métodos de intensificação, a eletroporação pode proporcionar entrega modulada e adequada de acordo com o tratamento. O protocolo de pulso e o desenho do eletrodo precisam ser otimizados para reduzir o principal efeito adverso, ou seja, a contração muscular (36).
Segundo o artigo de Yarmush et al,a eletroporação demonstrou criar vias aquosas através do estrato córneo e, assim, aumentar a distribuição transdérmica de drogas. Ao referir-se às suas propriedades elétricas, a pele é um tecido muito intrincado devido à sua estrutura altamente heterogênea. É composto por três camadas principais: epiderme (importante na resposta imune), derme (dá firmeza e elasticidade) e tecido subcutâneo (absorvedor de tensão mecânico, função termo-isolante). Mas a parte que mais define suas propriedades elétricas é a camada mais externa, o estrato córneo. Apesar muito fino (normalmente em torno de 20 ∝m), contribui muito para as propriedades elétricas da pele. É de baixa condutividade (três a quatro ordens de magnitude menor do que as condutividades das camadas mais profundas da pele) tornando a pele um dos tecidos menos condutores do ser humano. A resistência elétrica do estrato córneo é de ordem de magnitude maior do que a dos tecidos mais profundos, e o alto campo elétrico resultante da aplicação de pulsos elétricos permanece principalmente no estrato córneo. Com resultado da eletroporação, a resistência do estrato córneo diminui rapidamente e o campo elétrico se distribui nas camadas mais profundas do tecido (Figura 12)

O transporte molecular através da pele eletroporada ocorre através de diferentes mecanismos, principalmente a difusão aumentada durante e após a aplicação de pulsos elétricos e o movimento eletroforético com eletroosmose muito leve durante a aplicação de um pulso (31). Deve-se enfatizar que a reprodutibilidade da entrega de drogas (isto é, controle de dose) usando eletroporação é bastante pobre e representa um grande obstáculo no uso da técnica como um intensificador de entrega de drogas. A eletroporação pode, no entanto, ser prontamente usada para aplicações como entrega de genes.

A eletroporação pode ser usada para aplicações em que, após a injeção intradérmica, moléculas terapêuticas precisam ser inseridas em células viáveis da pele, um processo que está sendo cada vez mais testado para vacinação de DNA. Era de se esperar que a aplicação de pulsos elétricos na superfície externa da pele com intenção de atingir as camadas internas da epiderme através do estrato córneo altamente resistivo fossem de voltagens altas, muito altas. No entanto, como mostram os experimentos in vivo, as voltagens necessárias para a permeabilização da pele estão na faixa daquelas utilizadas em outros tecidos biológicos muito mais eletricamente condutores(32).

Para apoiar esta ideia foi descrito o processo de eletropermeabilização da pele através de um modelo numérico, levando em consideração a estrutura em camadas da pele e as mudanças de suas propriedades elétricas durante a eletropermeabilização. Tal modelo fornece uma compreensão mais profunda do processo de eletropermeabilização da pele e, ainda mais aprimorado, permitirá prever o resultado da entrega do pulso antes do tratamento, ajudando assim na otimização/escolha dos parâmetros de pulso corretos e no desenvolvimento de geometrias de eletrodos.
Outro mecanismo interessante descrito no trabalho de Yan K. et al foi a associação de microagulhamento e eletroporação. Para permear macromoléculas através da pele é importante superar a barreira do estrato córneo. Para enfrentar esse desafio, um novo tipo de sistema minimamente invasivo (EP IN-SKIN) foi desenvolvido nesta pesquisa. Este sistema consiste em uma varidade de microagulhas que atuam como microeletrodos para eletroporação formando um campo elétrico dentro da barreira da pele.

A partir dos presentes resultados da permeação cutânea in vitro de uma substância com peso molecular em torno de 4,3 kDa o FD-4 [isotiocianato de fluoresceína (FITC)- dextrano] concluiu-se que o tratamento com o microagulhamento (MN) ou o eletroporador (ON SKIN EP) sozinho aumentou a permeação de FD-4 através da pele de rato sem pêlos excisada, e o IN-SKIN EP aumentou ainda mais a permeação cutânea, o que foi considerado um grande efeito sinérgico de MN e ON-SKIN EP. Em particular, uma permeação mais alta foi alcançada ao aplicar tensão de eletroporação (EP) mais alta e de comprimento de pulso mais longa. A distribuição cutânea do FD-4 indicou a centralidade do local de aplicação da EP neste sistema. No presente estudo, a baixa irritação do IN-SKIN EP pode ser concluída a partir do experimento LDH -lactato desidrogenase, (um ensaio de vazamento de lactato desidrogenase (LDH) foi realizado para avaliar os danos na pele após o pré-tratamento IN-SKIN EP). Em conclusão, IN-SKIN EP pode efetivamente fornecer drogas de alto peso molecular e hidrofílicas. Não apenas as soluções medicamentosas, mas também as formulações tópicas, como gel, pomada ou adesivo, podem ser aplicadas após o pré-tratamento com IN-SKIN EP, podendo ser mais convenientes para aplicação clínica.

Lombry C et al descreveram em sua pesquisa o transporte transdérmico de macromoléculas através da EP. Concluiram que a entrega transdérmica de macromoléculas por alta voltagem é viável. Já era de conhecimento destes cientistas, pelos artigos publicados (33,34) que a entrega transdérmica de peptídeos (<6 kDa) pode ser aumentada pela eletroporação da pele. O transporte transdérmico de heparina (12 kDa) foi aumentado in vitro por eletroporação da pele para taxas terapêuticas potenciais. A entrega transdérmica e tópica de oligonucleotídeos (5 kDa) também pode ser aumentada pela eletroporação da pele. Além disso a eletroporação é um método muito eficiente para a transfecção de DNA em células em cultura, a eletroporação in vivo na presença de plasmídeo de DNA pode induzir a expressão gênica em vários órgãos. Se a liberação de macromoléculas por pulsos de alta voltagem foi relatada, a influência do peso molecular na liberação por eletroporação da pele nunca foi sistematicamente investigada. Os objetivos do estudo de Lombry C. et al, foram: 1) avaliar a viabilidade da entrega transdérmica de macromoléculas por eletroporação da pele, 2) avaliar a influência do peso molecular do permeante e examinar se existe um valor “cut-off” de peso molecular para entrega de drogas por eletroporação, 3) para localizar as vias de transporte das macromoléculas na pele. Uma série de FITC-dextrano de peso molecular crescente (4,4 kDa, 12 kDa e 38 kDa) (FD 4,4, FD 12 e FD 38) foi usada como macromoléculas modelo porque esses permeantes fluorescentes permitem tanto a quantificação do transporte transdérmico por espectroscopia de fluorescência quanto a localização na pele por microscopia de fluorescência. Em conclusão, este estudo foi o primeiro a avaliar sistematicamente a influência do peso molecular do permeante no transporte transdérmico e tópico por eletroporação cutânea. A eletroporação aumentou o transporte de macromoléculas: passivamente, a penetração de FD foi insignificante, enquanto um transporte significativo e uma penetração intracelular de FD foram detectados após a aplicação de pulso de alta voltagem. O transporte dependia do peso molecular: quanto maior o peso molecular, menor o transporte. A ausência de um “cut-off” de 40 kDa e a entrega da macromolécula de pelo menos 40 kDa sugerem que a eletroporação pode ser útil para a entrega terapêutica de grandes macromoléculas.
No trabalho de Zhang Y. et al, 2020 (35) caracterizando a resselagem de poros de membrana induzida por eletroporação células NIH/3T3 cultivadas em nove regiões foram eletroporadas com os mesmos parâmetros elétricos (três pulsos elétricos de 10 V com duração de 0,5 ms e intervalo pulso a pulso de 1 s) em sequência com intervalo de 3 min entre cada região. Depois que a eletroporação foi introduzida em todas as nove áreas, corantes de iodeto de propídio (PI) foram adicionados ao meio e, em seguida, a porção de células marcadas com fluorescência em cada região foi calculada. Observou se que, desta forma, os corantes foram adicionados às células na primeira e oitava regiões 24 e 3 minutos após a eletroporação, respectivamente. É interessante observar, uma queda significativa (de ~30% para 20%) na porção de células fluorescentes foi observada entre 9 e 12 min, indicando que os poros da membrana em algumas células eletroporadas foram novamente selados (ou seja, a eletroporação nessas células foi reversível). Em contraste, mesmo quando os corantes foram adicionados 24 minutos após a eletroporação, eles ainda poderiam entrar em ~ 20% das células, sugerindo que sua eletroporação é irreversível, ou seja, poros/danos permanentes foram introduzidos na membrana dessas células.

Para Denet A. R. et al, a exposição a um campo elétrico suficientemente forte também causa eletroporação em tecidos multicelulares, aumentando o transporte para dentro ou para fora de suas células constitutivas. A eletroporação uniforme é difícil de obter nos tecidos porque eles geralmente consistem em células de formas diversas, vários tipos de células (incluindo vascularização) e células conectadas por junções comunicantes, resultando em propriedades elétricas espacialmente variadas e muitas vezes anisotrópicas. Assim, mesmo que um tecido seja exposto a um campo elétrico externo homogêneo, dentro do tecido o campo é distribuído de forma altamente não homogênea, e algumas células são quase inevitavelmente eletroporadas mais intensamente do que outras. Para reduzir a não homogeneidade do campo, a entrega do campo elétrico a um tecido deve ser cuidadosamente projetada; é construído um modelo numérico do tecido, levando em consideração sua estrutura particular; o número, tamanho, forma e posicionamento dos eletrodos são então otimizados iterativamente até que a homogeneidade de campo suficiente seja alcançada dentro do tecido ou em um subtecido de interesse.

Uma vez que as células do tecido são eletroporadas, a condutividade elétrica e a permissividade dielétrica do tecido mudam, afetando a distribuição do campo elétrico. Particularmente quando mais de um pulso de eletroporação é aplicado, essas mudanças dinâmicas também devem ser consideradas para resultados ótimos. Em tais aplicações, a modelagem numérica é complementada por medições em tempo real da condutividade tecidual adquirida com os eletrodos que também são usados para eletroporação, permitindo que pulsos subsequentes sejam adaptados ao aumento detectado da condutividade refletindo a extensão da eletroporação. Embora a eletroporação já seja uma técnica consagrada em diversas áreas da medicina, muitas de suas aplicações biotecnológicas apenas começaram a surgir (37).

10. CONCLUSÃO

A administração de fármacos pela via transdérmica constitui uma alternativa viável para ultrapassar as limitações das vias mais comuns, tendo-se revelado uma área de investigação atrativa e desafiante. No sentido de diminuir a função barreira da camada córnea da pele e aumentar a permeação dos fármacos, várias estratégias têm sido desenvolvidas nas últimas décadas.

A eletroporação é uma técnica muito promissora para liberação de macromoléculas e drogas hidrofílicas por via transdérmica A eletroporação é uma tecnologia de plataforma multidisciplinar com múltiplas aplicações médicas..O sinergismo entre eletroporação, iontoforese, bem como os métodos químicos podem fornecer a força motriz necessária para a distribuição transdérmica. Embora uma compreensão completa dos mecanismos fundamentais nos níveis celular e tecidual ainda não tenha sido desenvolvida, sem dúvida veremos um aumento nas aplicações médicas da eletroporação nos próximos anos.



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Publicado por:
Mestranda em Harmonização Orofacial, Especialista em Harmonização Orofacial e Ortodontia, é coordenadora clinica dos cursos presenciais do Instituto Velasco, atuando em várias áreas dentro da Harmonização Facial. Atua na área desde 2011.